에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em> 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em> 성장 콘
Summary
MATLAB 기반, 오픈 소스 소프트웨어 패키지, plusTipTracker은 미세 소관 역학 정량화 형광 – 표지 + 팁 이미지 시리즈를 분석하는데 사용될 수있다.
Abstract
미세 소관 (MT) 플러스 – 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 이동 단말의 증가 플러스 끝에 지역화 및 MT 역학 1,2를 조절한다. MT 역학 분석에 가장 잘 알려지고 널리 이용 + 팁 중 하나는 모든 MT 성장 플러스 단부에 결합 최종 결합 단백질, EB1,이며, 따라서, MT 중합 한 마커이다. 성장 콘 내의 EB1 동작의 많은 연구는 개별적인 이동 단말 1-3를 분석 시간과 바이어스 된 컴퓨터 보조 손 추적 방법을 이용했다. 우리의 접근 방식은 고해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5에서 태그 EB1의 라이브 이미지의 취득 다음 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 사를 사용하여 MT 역학의 글로벌 매개 변수를 정량화하는 것입니다. 이 소프트웨어는 형광 표지 된 팁 + 영화 자동 감지, 추적, 시각화 및 분석을 결합 MATLAB 기반, 오픈 – 소스, 사용자 친화적 인 패키지. 여기서는 plusTipT를 사용하기위한 프로토콜을 제시배양하여 Xenopus laevis의 성장 콘에서 형광 표지 + 팁 혜성의 분석을위한 racker. 그러나,이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화하는데 사용될 수있다.
Introduction
이 방법의 목표는 정량적 인 미세 소관 (MT)에 관한 정보 플러스 – 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 성장 콘 생활의 역 동성을 획득하는 것입니다. MT + 팁은 이동 단말 9,10의 플러스 끝에 지역화 단백질의 그룹입니다. 그들은 중합, 재앙, 그리고 구조의 비율을 포함하여 MT 동적 불안정성 (11)의 매개 변수를 조절하는 다양한 기능을 수행합니다. MT 역학을 분석 한 잘 사용하는 방법은 성장 MT에 특이 적으로 결합 플러스 종료 1,12을 + 팁 EB1의 동작을 추적하는 것입니다. EB1은 성장 MT에 여러 개의 다른 단백질을 모집하는 것으로 알려져 플러스가 종료 MT 성장과 재앙 주파수 (15, 16)를 모두 촉진, 13, 14, 그리고 최근 MT 성숙 요인 15으로 설립되었습니다됩니다.
성장 콘 내에서 MT 역학의 많은 연구 EB1의 localizati로, 시간이 1 ~ 3 위에 EB1-GFP 역학의 변화를 측정하기 위해 손으로 추적 방법을 활용 한MT에게 플러스 단부 MT 중합 용 마커로서 사용될 수있다. MT 성장을위한 프록시로서 EB1-GFP 혜성 검사 용 주요 이점은 MT 역학 심지어 상당한 MT 오버랩 영역에서 측정 될 수 있다는 것이다. 손 추적 EB1-GFP 혜성의 방법은 MT에 유용한 통찰을 제공 하였지만 그것이 시간 소모적이며, 바이어스 될 수 있고, 행동들 1-3. 중요한 정보를 놓칠 수 있습니다 또한, 비정상적인 성장으로 콘 행동 가능성 (손으로 추적 할 때 일반적으로 필요한) 이동 단말의 일부만을 분석 골격 역학에 분 변화의 결과이다.
따라서, 우리는 높은 – 해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5 태그 EB1의 라이브 화상의 취득 후, 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 4를 사용하여 글로벌 MT 역학 파라미터를 측정한다. Danuser 연구소에서 개발이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화 여러 연구에 사용되었다. 그것은 우리를 오픈 소스입니다어 친화적 인 형광 표지 + 팁의 영화에 대한 자동 탐지, 추적, 시각화 및 분석을 포함 MATLAB 기반의 패키지로 제공된다. MT 역학의 특정 매개 변수가이 소프트웨어에 의해 계산됩니다의 긴 목록 (자세한 내용은 참고 4 참조)하지만, 성장 콘에서 MT 역학의 분석을 위해, 가장 유용한 매개 변수 (미크론 / 분) MT 성장 궤도 속도 아르, 성장 트랙 (초) 수명, 및 (미크론)의 성장 선로 길이. 소프트웨어 ( "소프트웨어"에서) Danuser 랩 웹 사이트에서 직접 다운로드 할 수 있습니다. Danuser 연구소는 현재 원래의 독립형 소프트웨어를 사용 가능한 상태로 유지하는 소프트웨어 패키지라고 불리는 U-트랙 2.0에 통합되어 + TIP 추적 분석을위한 새로운 인터페이스를 지원한다. 두 프로그램 사이의 기본 알고리즘은 인터페이스 및 분석 출력 만 차이, (적어도 2014 년 기준)와 동일하다. MATLAB 작은 및 / 또는 계산과 분석 체험관 초보자 용줬어은 plusTipTracker는 자동화 된 통계 매개 변수의 출력을 포함하여보다 사용자 친화적 인 기능을 가지고 있습니다.
여기서 우리는 배양 Xenopus의 laevis의 성장 콘에 EB1-GFP 역학의 이미지를 분석하는 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 MT 역학 (17)을 조사 최근 논문에서 사용되었다. 또한 로워 외를 참조하십시오. 2,012 5 EB1-GFP를 표현 배양 성장 콘에 대한 자세한 설명은. 이 논문은 주로 성장 원추의 EB1-GFP 역학 조사에 집중하지만, 동일한 프로토콜이 다른 세포 유형 (17)에 사용될 수있다. 모든 세포 유형의 경우, 프레임 간의 시간 간격은 최적의 TIP + 추적을위한 0.5-2 초 사이에 있어야한다. 프레임 간의 최대 4 초의 시간 간격이 가능하지만, 이것은 추가적인 추적 오차의 시간 간격 결과 증가 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker 신속하고 자동으로, 또는 세포 성장 원뿔 거의 모든 가시 EB1-GFP를 검출 혜성 혜성 트랙으로 링크 및 MT 파라미터를 계산하는 단순한, 그래픽 사용자 인터페이스를 제공한다. 다른 게시물은 (. 예를 들어, 마르크스 등 성장 콘 (18)의 태그 EB1 역학도 활용 정량 분석) 소프트웨어의 유사한 형태의 디자인이 신고되었습니다. 그러나,이 소프트웨어는 자유롭게 오픈 소스를 설계 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
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